Desarrollo de marcadores moleculares del tipo SCAR para la identificación de Azospirillum brasilense Az39 / Development of sequence characterized amplified región markers for identification of Azospirillum brasilense Az39

Resumen Azospirillum brasilense Az39 es utilizada por empresas productoras de inoculantespara la formulación de bioinsumos en América del Sur desde hace más de 30 a˜nos. Esta cepapuede promover el crecimiento, desarrollo, así como la capacidad de tolerar diferentes tiposde estrés en las plantas inoculadas, lo que determina un aumento de la productividad de culti-vos de interés agronómico. En la actualidad, no existen protocolos en Argentina que permitanconfirmar la identidad de Az39 en productos comerciales a nivel de laboratorios de control decalidad de inoculantes. Por ello, el objetivo de este trabajo fue desarrollar una metodología enbase molecular que permita la identificación certera de A. brasilense Az39. Con la secuenciacompleta del genoma y mediante herramientas bioinformáticas, se pudieron reconocer frag-mentos de ADN presentes únicamente en el genoma de Az39. Se dise˜naron cebadores dirigidosa amplificar por PCR dichas secuencias. Como resultado se observaron los productos específicosúnicamente en la presencia de la cepa de interés. La reacción pudo detectar un título mínimode 105UFC/ml (4,5 ng/l ADN) o de 102UFC/ml (0,88 ng/l ADN) o una concentración mínimade 0,098 ng/l ADN, dependiendo del método de extracción utilizado. Los cebadores fueronevaluados en el análisis de productos comerciales obtenidos del mercado nacional, arrojandoresultados positivos, tanto en muestras directas como así también en pruebas confirmatoriasa partir de colonias aisladas de tales productos. La metodología desarrollada en este trabajo,permite la detección certera de A. brasilense Az39 en cultivos puros o mezclas complejas demicroorganismos.

Abstract Azospirillum brasilense Az39 has been used since more than 30 years by several companies in South America for biofertilizers production. This strain may promote plants growth and development, as well as the ability of inoculated plants to tolerate environmental stresses, which determines an increase in the productivity under field conditions. At present, there are no protocols in Argentina to confirm the identity of Az39 in commercial products; however, such biofertilizers are formulated almost exclusively with this strain. Therefore, the objective of this paper was to develop a molecular methodology that allows the accurate identification of A. brasilense Az39. Using the complete genome sequence and several bioinformatics tools, fragments of DNA present only in the Az39 genome were recognized. A set of PCR primers to amplify these sequences were designed, and the specific products were observed only in the strain of our interest. The sensitivity of the methodology was evaluated, where the strain could be detected up to a titer of 105 CFU/ml (4.5 ng/pl ADN) or 102 CFU/ml (0.88 ng/pl DNA) or in a minimal concentration of 0.098 ng/pl DNA, depending on the DNA extraction methodology used. Primers were tested against direct samples of commercial inoculants and cultures, in both cases there were specifics products, both in direct samples and in confirmatory tests from isolated colonies from those products. The procedure presented in this paper allows the accurate identification of A. brasilense Az39 in pure cultures, mixtures of microorganisms, and commercial biofertilizers.

Search for endophytic diazotrophs in barley seeds

Eight endophytic isolates assigned to Pseudomonas, Azospirillum, and Bacillus genera according to pheno-genotypic features were retrieved from barley seeds under selective pressure for nitrogen-fixers. Genetic relationships among related isolates were investigated through RAPD. Six isolates displayed nitrogen-fixing ability, while all could biosynthesize indolacetic acid in vitro and showed no antibiosis effects against Azospirillum brasilense Az39, a recognized PGPR.

Efecto de la biofertilización y los biorreguladores en la germinación y el crecimiento de carica papaya L / Effect of biofertilization and bioregulators on germination and growth of carica papaya L

Con el objetivo de incrementar y acelerar el proceso de germinación de las semillas y obtener una alta producción y homogeneidad de plántulas de Carica papaya variedad Maradol en vivero, se evaluó el efecto de tres biofertilizantes aplicados solos o en combinación (Azotobacter chroococcum, Azospirillum brasilense y Glomus intraradices), y un biorregulador del crecimiento vegetal, el ácido giberélico (AG3), en la germinación y el crecimiento vegetal. Se realizó un experimento bajo un diseño completamente al azar con ocho tratamientos y tres repeticiones. A las semillas se les aplicó un pretratamiento germinativo con alternancia de temperatura para superar la dormancia. Los tratamientos simples con A. chroococcum y A. brasilense, incrementaron el porcentaje de germinación a 90,28 y 88,89% respectivamente. Además, con la aplicación de los biofertilizantes y el AG3, la velocidad de germinación se incrementó y el tiempo medio de germinación se redujo. La doble aplicación en semillas y foliar de los biofertilizantes y el AG3 en plántulas mejoró el crecimiento vegetal. La población de A. chroococcum fue mayor cuando se inoculó en combinación con G. intraradices. La prevalencia de colonización de las plántulas inoculadas con G. intraradices varió de 18,53 a 26,67%, con el mayor valor registrado para el tratamiento combinado con A. brasilense. Finalmente, aplicando esta metodología se logró acelerar la germinación, obteniéndose una mayor homogeneidad en la emergencia de las plántulas, disminuyendo así el tiempo de permanencia en el vivero.

In order to increase and accelerate the process of seed germination and obtain a high yield and homogeneity of papaya seedlings cv. Maradol in nurseries, we evaluated the effect of three biofertilizers applied single or in combination (Azotobacter chroococcum, Azospirillum brasilense and Glomus intraradices) and a plant growth bioregulator, the gibberellic acid 3 (AG3), on the germination and subsequent growth of papaya seedlings. An experimental design completely random with eight treatments and three replications were used. The application of a pre-germinal treatment with alternating temperature had to be applied to seeds to overcome dormancy. Single biofertilization with A. chroococcum and A. brasilense, promoted the germination percentage 90.28 y 88.89% respectively. Germination rate could be enhanced and the mean germination time was reduced with the application of biofertilizer and AG3. Both applications on seeds and leaves of biofertilizers and AG3, had a positive effect on plant growth. The population of A. chroococcum was higher in the combined inoculation with G. intraradices. The prevalence of colonization of plants inoculated with G. intraradices ranged from 18.53 to 26.67%, with the greatest values recorded for the treatment involving combined inoculation with A. brasilense. Finally, with the application of this methodology the seed germination rate was improved, as well as the uniformity of seedlings emergence...

Molecular characterization of nitrogen-fixing bacteria isolated from brazilian agricultural plants at São Paulo state / Caracterização molecular de bactérias fixadoras de nitrogênio isoladas de plantas brasileiras no estado de São Paulo

Fourteen strains of nitrogen-fixing bacteria were isolated from different agricultural plant species, including cassava, maize and sugarcane, using nitrogen-deprived selective isolation conditions. Ability to fix nitrogen was verified by the acetylene reduction assay. All potentially nitrogen-fixing strains tested showed positive hybridization signals with a nifH probe derived from Azospirillum brasilense. The strains were characterized by RAPD, ARDRA and 16S rDNA sequence analysis. RAPD analyses revealed 8 unique genotypes, the remaining 6 strains clustered into 3 RAPD groups, suggesting a clonal origin. ARDRA and 16S rDNA sequence analyses allowed the assignment of 13 strains to known groups of nitrogen-fixing bacteria, including organisms from the genera Azospirillum, Herbaspirillum, Pseudomonas and Enterobacteriaceae. Two strains were classified as Stenotrophomonas ssp. Molecular identification results from 16S rDNA analyses were also corroborated by morphological and biochemical data.

Quatorze linhagens de bactérias fixadoras de nitrogênio foram isoladas de diferentes espécies de plantas, incluindo cassava, milho e cana-de-açúcar, usando condições seletivas desprovidas de nitrogênio. A capacidade de fixar nitrogênio foi verificada por ensaio de redução de acetileno. Todas as linhagens fixadoras de nitrogênio testadas apresentaram hibridização positiva com sonda de gene nifH derivada de Azospirillum brasilense. As linhagens foram caracterizadas por RAPD, ARDRA e sequenciamento do gene 16S rDNA. As análises de RAPD revelaram 8 genótipos, as 6 linhagens restantes foram agrupadas em 3 grupos de RAPD, sugerindo uma origem clonal. ARDRA e seqüências de 16S rDNA foram alocadas em 13 grupos conhecidos de bactérias fixadoras de nitrogênio, incluindo organismos dos gêneros Azospirillum, Herbaspirillum, Pseudomonas e Enterobacteriaceae. Duas linhagens foram classificadas como Stenotrophomonas ssp. Os resultados da identificação molecular baseados em sequencias de 16S rDNA corroboram com dados obtidos em testes morfológicos e bioquímicos.

Aislamiento de Azospirillum de pasto navajita (Boutelosa gracilis) / Isolation of Azospirillum form roots of navajita grass (Bouteloa gracilis)

Se muestrearon raíces de pasto navajita (bouteoa gracilis), en diferentes áreas del estado de Durango, para aislar cepas fijadoras de nitrógeno del género Azospirillum. Las bacterias aisladas fueron sometidas a diferentes pruebas bioquímicas para su identificación y también se les determinó actividad nitrogenásica por cromatografía gaseosa. Se encontraron cepas de Azospirillum brasilense y A. lipoferum, clasificadas de acuerdo con las descripciones de diferentes investigadores. Se encontró que A. lipoferum presenta mayor actividad de reducción de acetileno a etileno (hasta 125 n moles/tubo/hora) en medio de cultivo NFb semisólido. A. brasilense produjo hasta 33 cultivo n moles de etileno/tubo/hora en medio de cultivo SNf, con ácido succínico como fuente de carbono